促进猪胃溃疡愈合的非pH依赖性生物黏附水凝胶
汇报人：研究生一年级戴隆超
研究背景
水凝胶是一种应用前景较好的生物医学材料。在无法将水凝胶放置于创面的情况下，最好在原位形成水凝胶。凝胶化的时间过长或者在靶部位的粘附力不足会导致治疗凝胶体积或者治疗药物的损耗[1]。凝胶所处的工作环境，例如体内的流体、化学和机械动态环境中，可能会影响它的治疗效果。在碱性条件下，邻苯二酚（Cat）可以在几分钟之内形成水凝胶[2]，许多与Cat有关的水凝胶在无机物和有机物表面都显示出很强的粘附性。但是当Cat暴露在空气中时，会被氧化成苯醌导致粘附性的丧失[3]。受贻贝足部蛋白（MFP）启发[4]，还原硫脲基团（NCSN）可以保持凝胶的粘附性。根据研究表明，Cat-NCSN生物黏附性水凝胶的形成不受pH的影响。聚合物前驱体溶液与氧化剂溶液的简单混合导致了透明质酸（HA）-Cat-NCSN水凝胶的快速形成，得到的HA-Cat-NCSN水凝胶在潮湿的酸性组织表面表现出了很强的粘附性与较长的黏附时间。相关文章“BioadhesivehydrogelsdemonstratingpH-independentandultrafastgelationpromotegastriculcerhealinginpigs”于年8月发表在sciencetranslationalmedicine杂志上。
图1凝胶制造过程以及可能的作用机制示意图
(A)HA-Cat和HA-Cat-NCSN水凝胶的制造工艺和可能的交联结构示意图。(B)通过向前体溶液喷洒氧化剂在胃中原位形成HA-Cat-NCSN水凝胶的示意图，以及水凝胶网络中丰富的Cat基团与组织表面蛋白质结合而导致的生物粘附机制。
研究内容
1.
非pH依赖性HA-Cat-HCSN水凝胶可以快速凝胶化
研究者用紫外-可见光谱(UV-Vis)追踪Cat在反应过程中的变化，在HA-Cat中加入NaIO4后立即出现了醌峰(λmax=nm)(图2A)，HA-NCSN的加入后使苯醌峰降低(图2B)，增加HA-NCSN的量或用过量的N，N-二甲基硫脲取代HA-NCSN，加速了对醌峰的降低(图2C），这表明NCSN基团将Cat(醌)还原为Cat。NaIO4：Cat的摩尔比为1：1，2%HA-Cat溶液在pH=7时，30min内可以形成水凝胶，pH=2时，需2h以上才能形成水凝胶。NaIO4：Cat的摩尔比为0.1：1，2%HA-Cat溶液不能形成水凝胶，1%HA-Cat和1%HA-NCSN的混合物在pH=2或7时，均能在5s内形成水凝胶。时间扫描流变学分析结果表明，pH=2或7时，HA-Cat-NCSN水凝胶的储能模量(G’)是HA-Cat水凝胶的4.5倍、4.3倍（图2E）。水凝胶力学性能的差异这可能归因于胶凝机制的不同，HA-Cat水凝胶依赖随机性的齐聚反应，因而它在水凝胶中的交联是不规则的，相反，HA-Cat-NCSN水凝胶由于高效的Cat-硫脲偶联导致NCSN和Cat之间的等摩尔反应，从而产生更均匀的交联结构。研究者在对不同的pH值和不同NaIO4的摩尔比情况下HA-Cat-NCSN凝胶的弹性模量进行测试(图2F)，结果表明HA-Cat-NCSN水凝胶形成的pH无关。根据压缩试验的结果，即使当NaIO4：CAT的摩尔比降低到0.1时，断裂应力也达到了约30kPa，断裂应变为75%(图2G)。HA-Cat-NCSN水凝胶在酸性缓冲液中的降解速度略快于在pH=7的缓冲液中(图2H)。与HA-Cat水凝胶不同的是，HA-Cat-NCSN水凝胶的制备速度快、氧化剂浓度低、pH值范围宽，且具有较好的力学性能等优势。
图2HA-NCSN水凝胶可以在潮湿的酸性环境下凝胶化且不受pH影响
（A）HA-Cat。（B）HA-Cat与HA-NCSN。（C）HA-Cat和NCSN单体(D)显示HA-Cat-NCSN和HA-Cat水凝胶凝胶行为的照片。(E)时间扫描实验(NaIO4：CAT摩尔比1：1)记录了HA-Cat-NCSN和HA-Cat水凝胶在pH=7和2时的储能模量(G’)和损耗模量(G’’)。(F)在不同pH值和NaIO4与Cat摩尔比(n=3)下形成的HA-Cat-NCSN水凝胶的平均弹性模量。(G)在不同pH(NaIO4：CAT摩尔比1：10)下形成的水凝胶的压缩试验。(H)水凝胶在pH=7和2的缓冲液中降解10天，m0代表原始水凝胶的重量，mt代表特定时间点的水凝胶的重量。
2.
HA-Cat-NCSN水凝胶的快速原位凝胶化和体外粘附性
HA-Cat-NCSN水凝胶除了使用化学氧化剂外，还可以使用蘑菇酪氨酸酶(MT)等氧化酶诱导凝胶化。当MT浓度从降低到50U/ml时，凝胶时间从2~4s增加到30min以上(图3A)。通过调节酶浓度可以制备凝胶化时间可控的水凝胶，使用低浓度的MT来减少由于快速凝胶化不均匀造成的测试伪影。磷酸盐缓冲盐水(PBS)孵育后HA-Cat-NCSN水凝胶的黏附强度降低，但在PBS中孵育的不同时间点(1、10min和过夜)的黏附强度差异无统计学意义(图3B)，表明HA-Cat-NCSN水凝胶即使在溶胀和潮湿的条件下也能保持粘附性。研究者将HA-Cat和HA-NCSN的混合物直接输送到NaIO4溶液中[~0.%(w/v)]后快速形成了线状水凝胶(图3C)。在酸性缓冲液中浸泡15min后，水凝胶仍然牢固地附着在玻璃表面。相反，纯HA-Cat前驱体溶液即使在喷洒高浓度NaIO4[~1.0%(w/v)]后也没有形成水凝胶(图3D)。这些结果显示，HA-Cat-NCSN水凝胶在酸性和潮湿环境中具有超快的凝胶化速度。将HA-Cat和HA-NCSN的混合物应用于新鲜猪胃组织，在酸性胃液(pH=2)中浸泡1h，以进一步证实该水凝胶在胃组织上的粘附性。结果表明，在喷洒氧化剂后的几秒钟内就出现了凝胶化现象。原位形成的水凝胶对胃湿表面有很强的粘附性，能够承受胃组织的过度拉伸和扭曲(图3E)。在胃液中浸泡含水凝胶组织30min后，附着的水凝胶仍能承受机械冲击而不脱离组织表面。从组织表面剥离水凝胶的尝试导致大量水凝胶残留在组织上，这表明我们的水凝胶具有很强的生物粘附性(图3E)。HA-Cat-NCSN水凝胶对组织的如此强的湿性粘附性可以归因于聚合物网络上丰富的Cat基团(由NCSN基团保存)对组织表面蛋白质上存在的各种天然亲核试剂(例如，酰胺键、硫醇和胺)具有很高的反应性。
图3HA-Cat-NCSN水凝胶展示了在潮湿和酸性环境下在玻璃和胃组织上的即时就地凝胶化
(A)不同浓度MT制备的HA-Cat-NCSN水凝胶的凝胶化时间。(B)用MT制备的水凝胶在PBS中孵育0、1、10min或过夜后的平均粘接强度。(C)直接将前驱体溶液注入氧化剂溶液，形成线状水凝胶。(D)将前驱体溶液涂抹在玻片上，并在玻璃表面喷洒氧化剂溶液，然后将玻璃浸泡在缓冲液中，从而制备水凝胶的示意图。凝胶的照片显示在右边。(E)在体外新鲜、潮湿的猪胃组织上形成粘性和稳定水凝胶的照片。
3.
HA-Cat-NCSN水凝胶促进啮齿动物模型溃疡愈合
研究者在啮齿动物溃疡模型上评价了HA-Cat-NCSN水凝胶治疗胃溃疡的疗效。每只大鼠(n=6)将醋酸溶液注入插入胃内的空心O形环模型，造成两个吻合性胃溃疡(图4A)。胃前壁溃疡喷洒水凝胶(水凝胶组)，后壁溃疡作为对照组(对照组)。术后第7天大体观察，水凝胶组溃疡面积明显小于对照组(水凝胶组：0.±0.cm2，对照组：0.±0.cm2)（图4B、4C）。苏木精-伊红(HE)染色结果显示对照组溃疡基底部较水凝胶组水肿更严重（图4D）。水凝胶在治疗溃疡后的第七天，中性粒细胞浸润和淋巴细胞较对照组显著减少。此外研究者对溃疡愈合的关键因素血管的生成和再上皮化，对水凝胶的治疗进行评估。CD31(内皮细胞标记物)免疫组化染色显示，水凝胶治疗的溃疡黏膜下层毛细血管密度显著增加(图4F，4G)。同样，水凝胶组在G1/S期的增殖标记物增殖细胞核抗原(PCNA)在溃疡基底部和边缘区域有较强的阳性染色（图4H）这些结果表明，HA-Cat-NCSN水凝胶应用于溃疡缺损，通过抑制炎症、促进毛细血管再生和促进细胞增殖，加速了胃溃疡的愈合。
图4使用HA-Cat-NCSN水凝胶治疗溃疡，抑制炎症，促进血管生成和细胞增殖
(A)建立大鼠吻合性胃溃疡模型的程序示意图，以及HA-Cat-NCSN水凝胶在溃疡表面的应用。照片在最右边。(B)大鼠第7天胃后壁和前壁接吻胃溃疡的典型图像。(C)对照组和水凝胶治疗组胃溃疡面积。(D)HE染色显微镜图像。(E)根据中性粒细胞和淋巴细胞浸润情况，在第7天获得溃疡炎症的组织病理学评估。(F)各组胃溃疡切片CD31、增殖细胞核抗原免疫组织化学染色。(G)每高倍视野(HPF)CD31阳性毛细血管的定量。(H)溃疡基底部及周围组织中增殖细胞核抗原阳性细胞百分率的定量。
4.
内窥镜下释放HA-Cat-NCSN水凝胶在猪体内胃溃疡上的牢固粘附
内窥镜下注射水凝胶对临床实践具有重要的模拟作用，是ESD手术后即时保护胃创伤、进一步促进溃疡愈合的理想方法。研究者在采用ESD对猪胃制造了两个人工性溃疡。治疗组使用内窥镜导管(通道1)将HA-Cat和HA-NCSN的前体混合物局部涂抹在溃疡基质上，然后立即通过另一个内窥镜导管(通道2)喷洒氧化剂溶液，以诱导快速的原位凝胶化(图5A)。对照组只接受ESD治疗，不进行水凝胶治疗。24小时后，内窥镜监测显示尽管上层部分丢失，但是HA-Cat-NCSN水凝胶持续粘附在溃疡基质上(图5B)。内窥镜手术48小时后，取胃组织进行组织学处理。如蓝色染料所示，水凝胶仍留在伤口上(图5C)。炎症标志物诱导型一氧化氮合酶(INOS)免疫组织化学染色显示，与对照组相比，水凝胶覆盖的溃疡部位INOS表达减少。结果表明，尽管在活体内存在过度的胃动力、酸性的pH和恶劣的生物流体环境，HA-Cat-NCSN水凝胶仍能在活体猪的胃溃疡部位牢固地粘附至少48h。
图5猪胃溃疡模型中HA-Cat-NCSN水凝胶在胃溃疡部位的原位快速凝胶化
(A)通过内窥镜导管将HA-Cat-NCSN水凝胶应用于经内窥镜黏膜下剥离(ESD)引起的猪胃溃疡的过程示意图。导尿管的照片显示在最右边。(B)对ESD制造人工溃疡、喷洒水凝胶的过程进行内窥镜成像，并在术后24小时和48小时对溃疡部位的凝胶滞留情况进行内窥镜监测。(C)术后48小时采集的猪胃组织的图像。
5.
HA-Cat-NCSN水凝胶促进猪溃疡愈合的实验研究
研究者对水凝胶疗法和现有药物硫糖铝对溃疡愈合的疗效进行了比较水凝胶和硫糖铝通过内窥镜导管输送，分别在第0天和第7天涂抹在溃疡上(水凝胶组和药物治疗组)；每头猪的第三个溃疡作为对照(对照组)(图6A)。每周进行内窥镜监测，评价溃疡愈合过程，直至第14天安乐死，收集样本。水凝胶组溃疡指数(最长半径×最短半径)在第7天和第14天均明显小于对照组，而第14天对照组与药物治疗组比较差异无统计学意义(图6B、6C)。第14天水凝胶组溃疡组织HE染色显示溃疡基底部有明显的再生上皮(图6D)。药物治疗也能诱导上皮再生，但腺体结构严重扭曲。第14天，对照组溃疡基底部几乎没有上皮细胞再生。组织学检查显示，水凝胶组在第14天中性粒细胞和淋巴细胞的浸润以及溃疡边缘高度均明显低于对照组(图6E、6F)。第14天水凝胶组较对照组再生上皮更多，形态正常，肉芽组织密度较高(图6G、6H)。第14天，药物治疗组和对照组溃疡边缘高度和肉芽组织厚度差异无统计学意义。用CD31和平滑肌肌动蛋白(α-SMA)双重免疫荧光染色检测水凝胶处理后的新生血管，结果显示毛细血管和小动脉密度显著增加。第14天水凝胶组肉芽组织与对照组比较有显著性差异(图7A~C)。增殖细胞核抗原染色结果还显示，水凝胶组溃疡基底部和边缘的阳性细胞核数明显高于药物治疗组和对照组(图7D、7E)。此外，水凝胶的应用，诱导了在第7天收集的溃疡样本中负责伤口愈合的基因的过度表达(图7F)。药物治疗对基因表达的影响较小，但CSF2和Ptgs2的表达高于水凝胶组，提示水凝胶和硫糖铝促进溃疡愈合的机制可能不同。在这项研究中，药物治疗组的疗效是建立在通过内窥镜钳将硫糖铝精确输送到溃疡部位的基础上，而患者实际口服硫糖铝并不能保证如此有效的输送药物，因此可能导致治疗效果较差。以上结果显示，HA-Cat-NCSN水凝胶疗效在促进胃溃疡愈合方面与传统药物疗法相当，HA-Cat-NCSN水凝胶甚至更好。
图6HA-Cat-NCSN水凝胶治疗促进体内胃溃疡愈合
（A）猪的实验时间表。分别于第0天和第7天进行两次水凝胶或药物治疗。于第14天取胃组织。(B)分别于第0、7、14天进行胃溃疡内窥镜检查。(C)溃疡指数计算为溃疡最长和最短半径的乘积。(D)各组第14天胃切片HE染色显微图像。从溃疡边缘和溃疡底部拍摄照片。(E~H)胃切片的组织学评价基于(E)炎症、(F)溃疡边缘高度、(G)腺体结构和(H)肉芽组织厚度。
图7水凝胶治疗促进了猪的细胞增殖和血管生成，并上调了与伤口愈合相关的基因
（A）水凝胶、硫糖铝处理组和对照组(未处理组)胃溃疡切片CD31(绿色)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA，红色)和增殖细胞核抗原(深棕色细胞核)免疫组化染色。(B)CD31阳性毛细血管的量化。(C)α-SMA阳性小动脉。溃疡基质中增殖细胞核抗原阳性细胞百分率的定量测定。(D)和溃疡边缘周围。(E)，(F)RT2ProfilerPCR芯片显示应用水凝胶后第7天与药物处理组和对照组相比，伤口愈合关键基因表达增加。
6.
HA-Cat-NCSN水凝胶分子隔离促进溃疡愈合的机制
在这项研究中，活/死细胞染色显示，包裹在HA-Cat-NCSN水凝胶中的大部分人胃上皮细胞(GES-1细胞)(~89%)和人骨髓间充质干细胞(~93%)在培养7天后仍然存活，从而证实了我们的水凝胶的细胞相容性。如以前的研究所示，胃液中存在的由低pH(≤3)激活的分解代谢因子，如胃蛋白酶，可通过降解促再生因子(包括促进血管生成和加速溃疡愈合所需的碱性成纤维细胞生长因子)来加重溃烂黏膜并阻碍愈合。同时，已知含有Cat基团的水凝胶可以通过与亲核基团反应捕获生物大分子。因此，研究者推测HA-Cat-NCSN水凝胶可能限制了大分子的运输，减少了溃疡部位对胃液中分解代谢酶的暴露，促进了细胞分泌的促再生因子在溃疡部位的积累，从而促进了溃疡的愈合过程(图8A)。使用胃蛋白酶(2mg/ml)溶解在pH=3的缓冲液中。在7d内，HA-Cat-NCSN水凝胶对胃蛋白酶从上腔到下腔的扩散明显低于MeHA水凝胶组和无水凝胶组。在第7天，只有45%的总胃蛋白酶通过HA-Cat-NCSN水凝胶扩散，而68%和85%的总胃蛋白酶分别通过MeHA水凝胶和没有水凝胶涂层的上腔扩散(图8B)。使用胃蛋白酶(2mg/ml)溶解在pH=3的缓冲液中。在7d内，HA-Cat-NCSN水凝胶对胃蛋白酶从上腔到下腔的扩散明显低于MeHA水凝胶组和无水凝胶组。在第7天，只有45%的总胃蛋白酶通过HA-Cat-NCSN水凝胶扩散，而68%和85%的总胃蛋白酶分别通过MeHA水凝胶和没有水凝胶涂层的上腔扩散(图8B)。使用了一种模型蛋白，牛血清白蛋白(BSA)，来测试蛋白质在水凝胶中的积累。在牛血清白蛋白溶液中孵育24小时后，HA-Cat-NCSN水凝胶比MeHA水凝胶积累更多的牛血清白蛋白(HA-Cat-NCSN：g/mg比MeHA：g/mg；图8C)。体内形成的HA-Cat-NCSN水凝胶可以保留促再生的内源性生长因子，并通过分子隔离限制分解代谢因子(如胃蛋白酶)的暴露，这一特性可能与体内动物实验观察到的水凝胶治疗后促进溃疡愈合有关。
图8HA-Cat-NCSN水凝胶通过隔离生物分子促进溃疡愈合
(A)假设原位形成的HA-Cat-NCSN水凝胶可以防止胃蛋白酶扩散到溃疡缺损处，并将细胞分泌的碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)保留在溃疡缺损区。(B)通过涂有HA-Cat-NCSN、MeHA或不涂有HA-Cat-NCSN的胃蛋白酶从上腔向下腔扩散的累积百分比。（C）HA-Cat-NCSN水凝胶或MeHA水凝胶在BSA酸性溶液中孵育24小时后的BSA吸收量。（D）三个处理组的GES-1细胞示意图和活/死染色图像。对照组在含有GES-1细胞的培养皿中直接加入0.2μg成纤维细胞生长因子。实验组用0.2μg成纤维细胞生长因子包埋或在含0.2μg成纤维细胞生长因子的成纤维细胞生长因子溶液中预吸附24小时后加入培养皿中。(E)每组(n=3)分别于第0、2、4、7天收集GES-1细胞。
总结与思考
可以通过内窥管向溃疡部位分别输送聚合物前驱体溶液与氧化剂溶液，诱导HA-Cat-NCSN水凝胶在胃内的原位凝胶化。瞬间形成的水凝胶能够粘附在胃溃疡部位，无论在猪胃内过度的胃动力、酸性pH和恶劣的生物流体环境，提供至少48小时的保护屏障，水凝胶通过抑制炎症反应、促进形成新生血管和细胞增殖来促进啮齿动物和猪的溃疡愈合，从而阻止外部分解因子的渗透，并在溃疡周围积聚生长因子。水凝胶的治疗效果与药物治疗(硫糖铝)组相当，这表明它是临床上治疗顽固性溃疡的一种可行的替代方案。
参考文献：
[1]J.Sedó,J.Saiz-Poseu,F.Busqué,D.Ruiz-Molina,Catechol-basedbiomimeticfunctionalmaterials.Adv.Mater.25,–().
[2].K.Zhang,Q.Feng,J.Xu,X.Xu,F.Tian,K.W.K.Yeung,L.Bian,Self-assembledinjectablenano